EL LABORATORIO EN EL PACIENTE HIV.

Ver: Introducción a Biología Molecular

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es la manifestación más grave de un espectro clínico de enfermedades que sigue a la infección por el Retrovirus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Se define por el desarrollo de infecciones oportunistas graves, neoplasias u otras manifestaciones potencialmente fatales resultantes de la inmunosupresión progresiva inducida por el HIV.(1)
El HIV se transmite a través del contacto sexual, drogadependencia endovenosas, transfusión de sangre y derivados y la transferencia madre –feto y madre –hijo.
El HIV es un Retrovirus linfotrópico que infecta primariamente y destruye los linfocitos
CD 4 + (linfocitos T helper). (1)
Estas células son cruciales para la inducción y regulación de la respuesta inmune. Su depleción progresiva por el virus causa una falla en la función inmune normal conduciendo a la inmunosupresión y subsecuente desarrollo a SIDA, con la aparición de infecciones oportunistas.(2)
El laboratorio en la estrategia de control de la infección por HIV, constituye hoy día una pieza fundamental, ya que posibilita su diagnóstico y permite reducir a un mínimo la transmisión transfusional. (3)
El HIV por su naturaleza RNA virus es altamente mutable, generando variantes viables y constituyendo un virus altamente elusivo al tratamiento.
Actualmente gracias a los aportes de la Biología Molecular se logró secuenciar el genoma viral, establecer mutaciones y deleciones en el mismo tendiente a lograr, si no una eliminación completa del virus, una disminución del virus circulante para minimizar sus efectos en el huésped. (3)

ASPECTOS VIROLOGICOS DEL HIV

DESCRIPCIÓN DEL VIRUS

El HIV pertenece a la familia Retroviridae, subfamilia Lentiviridae, fue descubierto en 1983. Se acepta la existencia de dos tipos de virus: el HIV-1, ampliamente diseminado en todo el mundo, del cual se han caracterizado varios subtipos (A, J, M, O) y el HIV-2 con elevada prevalencia en Africa Occidental, cuyo genoma coincide con el HIV-1 en un 40-50%.
El virus del HIV es una partícula esférica, constituido por una envoltura proveniente de la membrana externa de la célula huésped, en la que están incluidas numerosas espículas formadas por dos glicoproteínas: la gp120 (más externa) y la gp41 (de transmembrana). Debajo de la envoltura se encuentra la cáspside, de simetría icosaédrica constituida por la proteína p17. (3)
Dentro de la cáspside se encuentra el core de forma conoide y estructura proteica (proteína p24) que contiene al nucleoide constituido por dos cadenas de ARN monocatenario íntimamente relacionadas con las proteína p9 y p7 y la enzimas integrasa, proteasa y transcriptasa reversa. (4)
El genoma de HIV está constituido por dos secuencias terminales repetitivas largas (RTL) los genes env, gag y pol (genes estructurales comunes a todos los retrovirus) y una serie de genes reguladores (tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, vpx) que interviene en la replicación viral.
El gen nef al principio se definió como un regulador viral negativo pero posteriormente se demostró que regula en mas la expresión viral en ciertas circunstancia. (5)

CICLO REPLICATIVO DEL VIRUS

El paso fundamental en la infección por HIV es la fijación de la proteína gp120 al receptor celular CD4, proceso muy específico y eficiente ya que la afinidad de aquella por la molécula CD4 es mayor que la afinidad por la molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) clase II. Es decir, el CD4 actúa como receptor primario para el HIV, el cual se expresa en: Linfocito T CD4+ y células del linaje monocítico-macrofágico. También infecta otros tipos celulares que expresan cantidades variables de CD4 o incluso que carecen de una expresión detectable: megacariocitos, células dendríticas, células epidérmicas de Langerhans, astrocitos, oligodendroglia y microglia, células CD8+, del cuello uterino, rectales, trofoblásticas, renales miosíticas y retinianas. (1),(3)

Trabajos recientes indican la existencia de por los menos dos co-receptores que median en el proceso de fusión. Estos mediadores se describen como receptores para citoquinas. El mayor co-receptor para la cepas macrófago trópicas de HIV (M-tropic o cepa R5) es el receptor para las beta quimoquinas 5 (CCR5), mientras que el CXCR4 lo es para las cepas Linfocito T trópicas (LT tropic o cepas X4). Se encontró que individuos infectados sanos HIV positivos poseen una resistencia innata a la infección. Esto ha instado a investigar las variantes genéticas de individuos negativos pertenecientes a grupos de alto riesgo de infección por HIV que carecerían de los receptores de la beta quimoquinas. El mecanismo protectivo del polimorfismo génico de CCR5 esta asociado a la modulación de su expresión en la superficie de las células blanco. (6)

Después de la fijación, el virus se fusiona con la membrana celular y es internalizado en una reacción poco conocida que parece involucrar a la proteína gp41.
Después de la internalización y la pérdida del revestimiento viral, la enzima viral transcriptasa reversa (RT) transcribe el RNA viral en DNA bicatenario que puede circular como episoma y no integrarse, o a través de la acción de la enzima integrasa ,puede ser integrado como provirus en el DNA celular. Cuando la célula infectada es activada posteriormente, se transcribe el DNA proviral con producción de RNA, síntesis y procesamiento de proteínas, ensamble del virus y gemación de la célula.
La activación celular es importante en la expresión del HIV. Distintas señales activadores entre ellas antígenos, virus heterólogos y citoquinas son capaces de aumentar la expresión viral de células crónicamente infectadas. La estimulación de las células T activa varios factores de transcripción, incluido el factor de transcripción celular NF-KB, que luego inducen la transcripción de genes específicos involucrados en la respuesta de las células T.(6)

DINAMICA VIRAL

La cantidad de virus circulante es el resultado de un equilibrio dinámico entre producción del HIV en el tejido linfático y su neutralización por parte del sistema inmunológico. Se estiman que se producen y se destruyen (clearence viral) 10¹⁰ partículas vírales diariamente en un individuo infectado, esto significa que la mitad de los virus circulantes son recambiado cada día, por lo tanto la vida media del HIV en plasma es de 24-48 horas. Esta masiva producción de virus va acompañada de la destrucción y remplazo de casi dos millones de células CD 4 + por día. (7)

DIVERSIDAD GENÉTICA

La dinámica de la replicación del HIV tiene grandes implicancias en la generación de una diversidad genética (cuasi especies) dentro de un mismo individuo. Cultivos de virus aislados de pacientes con infección reciente, presentan una baja tasa de heterogeneidad genética, mientras que los aislados de pacientes con un tiempo de infección más prolongado, demuestran una gran diversidad. Esto se debe a la cinética de replicación y a la capacidad de mutación que tiene la transcriptasa reversa frente a la respuesta inmune del huésped. (7)
La mayor parte de estas mutaciones ocurren en el gen de la envoltura y se ha demostrado en las proteínas de la envoltura que estas diferencias determinan una capacidad citopática del virus. Además las diferencias en la capacidad de las cepas variantes de HIV para infectar células T primaria o monocitos macrófagos in vitro parecen deberse a cambios en la región de la envoltura. (1)
El rápido recambio provee el mecanismo idea para la producción de mutaciones s que permite escapar del control inmunológico de la infección o que confieren resistencia a drogas. Cuando las drogas que inhiben la replicación son administradas inapropiada mente, genera una presión selectiva en la evolución hacia cepas resistentes. Existen cepas que crecen preferentemente en macrófagos y no forman sincitios celulares (HIV-NSI) de menor patogenicidad. En fase más tardía de la enfermedad se detectan más variantes citopática de HIV que crecen bien en las células T. Estos aislamientos se identifican como cepas inductoras de sincitios (HIV-SI), más citotóxicas, responsables de la declinación aceleradas de células T CD4 +. (13)

ANOMALÍAS DE CELULAS T

Después de la infección los linfocitos T CD4+ totales caen en forma precipitada coincidiendo con el pico de viremia, así mismo los signos y síntomas se asocian con un síndrome viral agudo.
A medida que la viremia se resuelve, las células T CD4 + totales pueden elevarse hasta niveles casi normales. Durante el período de latencia clínica (que puede durar hasta 10 años) los niveles de CD4+ declinan a ritmo que varía en los distintos individuos.
Se han postulado distintos mecanismos para explicar la depleción de células T CD4+:
a) Infección directa con citopaticidad
b) Destrucción indirecta de células T
c) Incapacidad para regenerar células T madura
d) Autoinmunidad

ALTERACIONES FUNCIONALES DE LAS CÉLULAS CD4 +

Los individuos HIV + asintomáticas son anérgicos en las reacciones cutáneas de hipersensibilidad retardada (por ejemplo una reacción de PPD puede dar negativa.)
Otro trastorno funcional de las células T comprende un desequilibrio entre las células T helper 1 y 2 y las citoquinas que producen. Ambos subgrupos activan la inmunidad celular y humoral respectivamente. Existe un desequilibrio entre funcionamiento de esos dos subgrupos y haciéndose predominante el subgrupo de las células T helper 2 durante la progresión de la enfermedad.(8)

ANOMALÍAS EN LAS CÉLULAS T CD8+

Estas células se encuentran disminuidas en el periodo agudo de la infección por HIV. En 3 o 4 semanas el recuento de las mismas retorna a la normalidad o supera los niveles normales.
Los enfermos de SIDA con infecciones oportunistas y células T CD4 disminuidas generalmente presentan una disminución de células T CD8, lo cual podría reflejar una pérdida de la capacidad de las células progenitoras para generar nuevamente células T maduras.

CITOQUINAS
Las células B de los individuos infectados por HIV secretan factor de necrosis tumoral (TNF- alfa) e interleuquina IL-6, esto es importante en el medio ambiente del ganglio linfático donde las células T CD4+ infectadas que migran, encuentran un medio permisivo de citoquinas que sostiene la replicación viral activa. (1)

DIAGNOSTICO DE INFECCION POR HIV

Existen métodos directos e indirectos de laboratorio para la detección de HIV. Los métodos directos detectan la presencia del virus completo, sus proteínas o sus componentes genéticos. Estos incluyen ensayos de captura del antígeno p24, cultivo viral y PCR.
Los métodos indirectos detectan la presencia de anticuerpos, incluyendo ensayos de screening o tamizaje y pruebas suplementarias o confirmatorias.(9)

MÉTODOS DIRECTOS

Se utilizan para resolver situaciones donde la serología no permite llegar a un diagnóstico definitivo. Están indicados para:

• · Pacientes que han tenido contacto reciente con personas HIV confirmadas o en accidentes laborales.
• · Evaluación de la evolución de la enfermedad.
• · Individuos con sintomatología sospechosa no confirmada por la presencia de anticuerpos (serología indeterminada).
• · Confirma la infección en niños nacidos de madres HIV positivas.

Determinación de Antígeno p24
Marcador diagnóstico de infección primaria por HIV. Es una proteína viral que se cuantifica por el método de disociación de inmunocomplejos (DIC), el cual consiste en la disociación ácida o alcalina de los inmunocomplejos aumentando la sensibilidad de la prueba. Los niveles aumentan rápidamente luego de la infección aguda y declinan haciéndose indetectables para esta prueba.
En adultos es detectado con anterioridad a la seroconversión, también en etapas tardías de la enfermedad. La detección de Ag. p24 en suero aumenta el riesgo de progresión a la enfermedad.
En pediatría dos muestras tomadas en tiempos diferentes y positivas para Ag. p24 establecer el diagnóstico de infección.
La detección de Ag. p24 no tiene una estrecha relación con la determinación de carga viral y existen varios factores que influirían en la variabilidad de estos marcadores subrogantes.
Una resultado de carga viral alta y niveles bajos de Ag. p24 pueden ser debidos a un RNA defectivo y que no se expresa en proteína p24. (10)

Cultivo viral
Se usa como marcador pronóstico de la infección por HIV, generalmente la determinación de la infección se realiza midiendo Ag. p24 en el sobrenadante de cultivo celular. Se utilizan líneas celulares T o linfocitos frescos de cordón umbilical. El cultivo celular debe ser estimulado por mitógenos e interleuquinas 2.(11)

Reacción en cadena en la polimerasa (PCR)
Constituye una técnica altamente sensible que logra detectar hasta una copia de ADN viral o provirus, mediante amplificación de un segmento seleccionado del provirus presente en el ADN de las células infectadas por HIV-1.Especialmente utilizada para realizar el diagnóstico precoz de infecciones por el HIV-1 en niños menores de 18 meses de edad y se puede lograr una sensibilidad y especificidad del 100%.(12)

TMA: (Transcription Mediated Amplification ) determina la presencia del virus de la hepatitis C consta de tres etapas:
1) preparación de las muestra donde se libera en material genético de la partícula viral y se separa por hibridación sobre una partícula magnética
2) TMA donde se da la amplificación isotérmica del RNA con un intermediario de DNA doble hebra
3) detección hibridación con sondas marcadas con ester de acridina y posterior oxidación que genera una señal tipo flash para el control interno y una señal “lenta”para el material genético de la muestra..tiene una sensibilidad de 5 IU/ml .es 10 veces mas sensible que las técnicas de PCR.

MÉTODOS INDIRECTOS

La producción de anticuerpos generalmente es detectable 4 - 12 semanas después de la infección y continúa en el tiempo. Esto es estimulado por la persistencia del virus, aún cuando se encuentre restringido al sistema retículo endotelial por años. (11)
Se clasifican en:
· Pruebas de tamizaje
· Pruebas confirmatorias
Pruebas de tamizaje: Son técnicas de gran sensibilidad que permiten la pesquisa de individuos infectados, pudiendo generar resultados falsos positivos, por lo tanto no se utilizan como diagnóstico definitivo.(3)

Enzimoinmunoensayo (ELISA)
Estas técnicas utilizan soportes en fase sólida (policubetas, membranas, perlas) sobre los cuales se absorben varias formas de los antígenos de HIV (lisado viral, proteínas vírales purificadas o recombinantes, péptidos sintéticos). Los que utilizan lisado viral contienen un numeroso y amplio rango de sitios antigénicos, que representan la mayoría de las proteínas del HIV. Esto asegura la detección de anticuerpos contra diferentes subtipos de HIV y reduce la posibilidad de perder variantes, pero compromete la especificidad del ensayo, dando lugar a resultados falsos positivos. Sueros conteniendo anticuerpos que reconocen un epitopes, compartido por HIV y otros virus o bacterias, o anticuerpos que unen antígenos leucocitarios humanos y otros componentes de la célula del huésped presentes en lisado, son falsamente reactivos. Esta reactividad se evita usando proteínas recombinantes o péptido sintético como fuente de antígeno. De todas maneras los péptidos recombinantes pueden contener contaminantes (proteínas de bacterias o levaduras) e incluso restos antigénicos, provenientes de las proteína de fusión, que causen algunos resultados falsos positivos. En síntesis, los péptidos recombinantes permiten un aumento de sensibilidad y pronta detección de la seroconversión.
En los ELISA de última generación el conjugado es el antígeno viral, con lo cual se acorta el período de ventana serológica debido a la posibilidad de detectar distintas clases de inmunoglobulinas.(3)

Pruebas de aglutinación
Los antígenos vírales son unidos a micropartículas que pueden ser de distinto material (de látex, gelatina, sintéticas o glóbulos rojos). La sensibilidad de esta técnica es similar al ELISA.(3)

Inmunodot
Los antígenos vírales son recombinantes o sintéticos y se encuentran unidos a una membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plástico.(3)

PRUEBAS CONFIRMATORIAS
En algunas ocasiones otros anticuerpos de distinto origen del HIV pueden dar reacción cruzada en las pruebas de screening. Un resultado positivo debe ser confirmado por uno o más métodos alternativos. Los tres métodos que han sido aprobados son los siguientes:

Western-blot (WB)
Detecta anticuerpos contra HIV usando enzimas conjugadas a anticuerpos anti-inmunoglobulina humana y proteínas de HIV inmovilizadas en fase sólida. Las proteínas son previamente separadas electroforéticamente y luego transferidas a membranas de nitrocelulosa sobre las que se efectúa un ELISA indirecto. La intensidad de cada banda se evalúa visualmente comparándola con una tira control que exhibe todas las proteínas principales. El resultado de WB se interpreta como positivo, indeterminado o negativo sobre la base del número y tipo de bandas observadas en cada tira. Se han establecido diferentes criterios de interpretación por distintas organizaciones.(11)(2)
El criterio utilizado en nuestro laboratorio es el de la ASTPHLD (Association of State and Territorial Public Healdth Laboratory Directors ) y el del Center Disease Control (CDC) que establece:
WB positivo: Cuando presenta por lo menos dos de las siguientes bandas p24, gp41, gp120/gp160.
WB negativo: Ausencia total de bandas.
WB indeterminado: Presencia de cualquier banda sin que se cumpla el criterio de positividad (3). Este resultado puede resolverse por PCR o repitiendo el WB en 3-6 meses. El CDC recomienda considerar como negativo un resultado WB indeterminado estable por lo menos por 6 meses en un individuo asintomático. (11)(3)

MARCADORES SUBROGANTES

Los marcadores virológicos e inmunológicos adquieren un rol primordial en el monitoreo de la progresión de la enfermedad y de la respuesta al tratamiento antirretroviral. Estos marcadores son importantes para determinar el pronóstico y la mejor estrategia a seguir en cada paciente.
Un número de diferentes marcadores, también llamados marcadores subrogantes tales como recuento de CD4+, beta 2 microglobulina, neopterina, antígeno p24 con disociación de inmunocomplejos (ICD) , formación de sincitios (SI vs NSI) han sido utilizados como alternativa. Pero existe consenso que la medición por métodos moleculares del HIV - RNA es mejor para monitorear la infección por HIV. (10)

Recuento de linfocitos CD4+
Es el marcador más sensible para establecer el daño inmunológico que caracteriza la enfermedad, sin embargo no es suficiente para establecer el riesgo de progresión de enfermedad. Cuando el recuento es mayor de 500/mm³, existe muy poca probabilidad de desarrollar la enfermedad. Existen limitaciones como:
1) Variaciones del laboratorio en las mediciones de CD4+, además de las fluctuaciones debidas a: ejercicio físico, momento del día de la extracción, enfermedades concurrentes menores.
2) Marcada disociación entre la respuesta CD4+ y el desarrollo clínico. El cambio en el tiempo de los valores absolutos de distintas mediciones de CD4 es de mayor valor predictivo, es un test subóptimo para medir la respuesta a antirretrovirales.
3) El conteo de CD4 esta asociado con un mayor grado de variabilidad. Personas con conteo de CD4 + similares pueden diferir en sus futuros valores, en la variabilidad de los valores de descenso y en su riesgo de progresión clínica.
4) El preciso rango normal del conteo de células CD4 + no esta establecido claramente. Las mediciones de CD4 + muestran variaciones intramuestra. (10)

Beta 2 microglobulina
Aparece en la superficie de toda célula con núcleo. Es un débil marcador de progresión y sobrevida en pacientes con HIV. Se encuentra aumentada durante la activación de los linfocitos, correlacionándose inversamente con el conteo de CD4+. Su valor pronóstico es mejor si se lo utiliza en conjunto con el conteo de CD4. (10)

Neopterina
Marcador de una baja respuesta a la terapia, no es útil para predecir evolución de la enfermedad. Esta inversamente correlacionada con el conteo de CD4+. Altos niveles de neopterina sérica están asociados con un estado avanzado de enfermedad. (10)

Fenotipo Biológico
Marcador de la evolución clínica. Las características de crecimiento de los aislamientos de HIV luego de un cocultivo de células mononucleares periféricas, tienen correlación con la virulencia del virus.
En la línea celular MT-2 los aislamientos producen dos variantes principales: los formadores de sincicios (SI) y las no formadoras de sincicios (NSI).
Las SI replican rápidamente y aumentan la probabilidad de selección de mutaciones resistentes y tienen un marcado tropismo por células T (linfotróficas) y están asociadas con un aumento del riesgo de progresión de la enfermedad. La aparición de cepas SI antes de la aparición del SIDA es un marcador pronóstico para una rápida declinación de los niveles de CD4 + y subsecuente progresión a la enfermedad.(10)
Las NSI replican muy lentamente, y tienen tropismo por los macrófagos (macrofagotróficos). Una cepa NSI puede variar a SI, si ocurre esto, el tiempo que transcurre hasta la aparición de enfermedades oportunistas es de 6-8 meses.
Para este marcador existe un grado de variabilidad poco aceptable para el seguimiento de la evolución clínica. (10)

CARGA VIRAL PARA HIV

La medición de carga viral es una prueba para determinar la cantidad del virus en plasma, usando una tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite la amplificación y la identificación de secuencias específicas de DNA o RNA o utilizando branched HIV-1 RNA (b-DNA) . Es una tecnología de amplificación de señal para la cuantificación directa de ácidos nucleicos virales tal cual circulan fisiológicamente en suero del paciente infectados ya que no hay amplificación del material genético. Los ensayos de b-DNA utilizan estándares que son calibrados contra un gold estándar que es validado por tres métodos analíticos independientes (espectrofotometría, análisis de fosfato ,hipercromicidad) ,esta designado para cuantificar la carga viral de los subtipos no B, que su prevalencia esta aumentando en el mundo.
Tiene un valor pronóstico que permite su utilización para recomendar el inicio del tratamiento y planear una estrategia terapéutica para cada paciente.
Esta prueba se realiza según las directrices siguientes:

• a) Para establecer la línea de base se realizan dos cargas vírales.
• b) Los pacientes con enfermedad clínicamente estable, deben pasar por una prueba cada cuatro meses, siempre seguida del conteo de linfocitos CD4.
• c) Cuando se realizan cambios en la terapia, el monitoreo se hace con más frecuencia. La carga viral debe ser monitoreada en la línea de base (obtener dos lecturas con cerca de una semana de intervalo) y luego donde se encuentra el pico máximo de la droga o combinaciones de las drogas (2-12 semanas después de iniciada la terapia).

Los niveles del HIV RNA fluctúan durante el curso de la infección. (14)
Usar la medición de carga viral para evaluar el tratamiento tiene ventajas sobre otros marcadores clínicos vírales, ya que:
-Se produce la medición directa del blanco del tratamiento
-Repercusión rápida del efecto del tratamiento o de la pérdida de su efecto en– 2 a 4 días.
Tiene un beneficio pronóstico adictivo cuando se usa combinado con el cálculo de las células CD4+.
Los niveles plasmáticos de HIV RNA pueden reflejar replicación viral activa en el tejido linfoide.
La variabilidad biológica para estos ensayos moleculares es de 0,3 log. Los cambios ocurridos en los niveles de RNA en plasma mayores de 0,5 log. reflejan cambios en los niveles de replicación viral.
En pediatría la carga viral resulta predictiva del deterioro clínico después del segundo o tercer mes de vida. (15)
En mujeres embarazadas hay una fuerte asociación entre el número de copias de HIV RNA y la probabilidad de transmisión de la infección de madre al niño.
La carga viral no informa del efecto de otras variables pronósticas, como la resistencia a las drogas y la virulencia del fenotipo viral.
La infección por HIV persiste aunque los niveles de HIV RNA son indetectables por los métodos corrientes de carga viral. El DNA proviral es aún detectable en células mononucleares de sangre periférica y tejido linfoide.
La definición de carga viral indetectable depende del ensayo utilizado.
El tratamiento debe ser iniciado cuando la carga esta entre 5.000-10.000 HIV RNA copias/ml para la técnica de PCR. La medición de la carga viral se debe hacer a las 4, 16 y 24 semanas. La semana 16 se usa para evaluar el éxito o falla del tratamiento y tomar una decisión clínica. El valor de supresión de la carga viral en la semana 24 de tratamiento se correlaciona con la continuación de la supresión a la semana 40. (16)
Cuando se utiliza carga viral ultrasensible el tiempo para ver el descenso de la misma es más de 16 semanas. (14)

RESISTENCIA A DROGAS ANTIRRETROVIRALES

La terapia antirretroviral previene la replicación viral a niveles no detectables y por el mayor tiempo posible. Reduciendo así la progresión de la enfermedad
Cuando se produce falla en el tratamiento, puede ser debido a:

• · Baja adherencia por el paciente, lo cual lleva a una supresión subóptima de la carga viral y una generación más rápida de resistencia.
• · Resistencia viral codificada genéticamente
• · La presencia de variantes vírales resistentes a las drogas tendrá incidencia en el fracaso de la terapia.
• · Efectos farmacocinéticos y metabólicos de la medicación.
• · Falla inmune del huésped.

La resistencia a una o varias drogas antirretrovirales podría definirse como cambios que mejoran o incrementan la replicación viral en presencia de inhibidores. Es el resultado de un fenotipo alterado por cambios del genotipo viral preexistente que puede medirse tanto in vitro como in vivo.
Los fenotipos resistentes se determinan teniendo en cuenta la capacidad de replicación de las cepas vírales en presencia de una droga comparada con una cepa sensible
La susceptibilidad a la droga es expresada como concentración inhibitoria 50 0 90 (CI 50 o CI 90), es decir la concentración de droga que inhibe el 50% o el 90% de la replicación viral. (18)
La resistencia a la droga in vivo se ve reflejada en un incremento en la carga viral y se asocia con el fenotipo y/o genotipo. (18)

METODOLOGÍAS EMPLEADAS EN EL ESTUDIO DE GENOTIPOS RESISTENTES

Permiten determinar alteraciones en el genoma viral que pueden resultar en cambios de la secuencia de aminoácidos de las proteínas vírales transcriptasa reversa (TR) y proteasa (PV).
La metodologías son dos:

• 1- Ensayos de secuenciación
  Proveen información sobre todas las mutaciones presentes en la región genómica analizada y que potencialmente pueden asociarse a resistencia. Hay dos clases de métodos secuenciación cíclica, Hibridación de oligonucleótidos.
• 2- Determinación de mutaciones puntuales
  Comprenden: PCR en primers específicos y hibridación diferencial (LIPA)

METODOLOGÍA EMPLEADA EN EL ESTUDIO DE FENOTIPO
Este método se basa en realizar el aislamiento del virus a partir de la sangre de un individuo infectado, amplificarlo y cuantificarlo. (19)

INFECCIONES OPORTUNISTAS

Con el advenimiento del síndrome de inmunodeficiencia (SIDA) adquirida deben investigarse en estos pacientes microorganismos considerados oportunistas además de los que habitualmente se estudian en los distintos materiales.

INFECCIONES DE LA PIEL

Una de las primeras manifestaciones clínicas de la infección por HIV es la lesión en piel. Esto ocurre por una alteración del sistema inmunológico. En estos pacientes puede además infección sistémica.

1-Bacterias que deben investigarse:

• Bartonella henselae y B. quintana son agente causal de la angiomatosis bacilar y la peliosis bacilar que se manifiesta con lesiones cutáneas y lesiones vasculares subcutáneas Estos microorganismos deben buscarse en muestras de sangre y tejidos.
• Staphylococcus aureus: es el microorganismo causal de la mayoría de las infecciones cutáneas. Las lesiones son del tipo del impétigo, celulitis abscesos.
• Treponema pallidum: Las manifestaciones cutáneas en los pacientes HIV + son atípicas enmascarando el diagnóstico. La serología en estos casos no tiene mucho valor ya que la respuesta inmune se encuentra disminuida.
• Nocardia spp: Son comunes en los pacientes que están severamente comprometidos. La puerta de entrada puede ser la inoculación en la piel. La nocardiosis cutánea se puede subdividir en: micetoma, infección linfocutánea, infección superficial de piel e infección diseminada con involucramiento cutáneo secundario. En Argentina N. brasiliensis es el agente etiológico más común de los actinomicetomas, el cual afecta frecuentemente al pie.
• N farcinica produce una variada de manifestaciones clínicas entre ellas infecciones cutáneas. Es importante diferenciarla debido a la alta resistencia a los antimicrobianos
• Mycobacterium tuberculosis: La tuberculosis cutáneas puede ocurrir por infección directa de una fuente exógena o por autoinoculación o diseminación endógena de otro sitio. Pueden aparecer en el curso de una infección diseminada o constituir la única evidencia en una lesión de la infección por micobacterias. La presentación puede ser en forma de máculas, pápulas o úlceras tanto en el tronco como en las extremidades. El diagnóstico se realiza por baciloscopía y cultivo de material obtenido o por biopsias o raspados de las lesiones. Debido a que la tuberculosis puedes ser multirresistente en pacientes con SIDA es indispensable determinar la sensibilidad antibiótica. (20)
  Mycobacterium avium-intracellulare (MAC): Cuando aparecen las manifestaciones cutáneas es porque la infección se ha diseminado. Siempre esta asociada al SIDA. El diagnóstico se realiza por baciloscopía y cultivo de las lesiones. (21)

2-Agentes vírales que deben investigarse:

• Herpes simple (VHS): Causan lesiones en la piel en pacientes inmunocomprometidos, especialmente HIV+ . En fase temprana de al enfermedad aparece la causadas por VHS siendo autolimitada y en fase más avanzada las manifestaciones cutáneas persisten. El diagnóstico se realiza tomando material de la lesión. El estudio ser realiza por cultivo, IFD, PCR. Los test serológicos no tienen valor
• Molluscum contagiosum: Las lesiones cutáneas se manifiestan generalmente en la cabeza y en cuello en pacientes con recuento de CD4+ <200celulas / mm3.

3-Agentes micóticos .

• Cryptococcus neoformans- Coccidioides inmitis- Hystoplasma capsulatum: Criptocococis es una de las primeras manifestaciones de la infección sistémica presentándose en un 5-10 % de los pacientes con HIV. En los pacientes con enfermedad avanzada se observan lesiones cutáneas debido a C. inmitis.
  La manifestación cutánea de la histoplasmosis diseminadas en pacientes HIV se presenta en forma papular, hemorrágica y úlcero necrótica.
  El diagnóstico de las micosis se realiza obteniendo material de la lesión o por biopsia. El cual se observa en fresco. Con tinta china con coloración de Giemsa. Se pude buscar el antígeno de Cryptococcus neoformans en sangre o en LCR. También se realizan cultivos. (20)

LESIONES EN LA MUCOSA BUCAL

Su reconocimiento clínico temprano, el correcto diagnóstico forma parte del seguimiento de las enfermedades de la boca y anexos asociados al SIDA. Desempeñan un papel importante en la estadificación de la infección por el HIV.

1-Micóticas:

• Candida spp.: Es la más común de las micosis oral, siendo C. albicans la especie mas habitualmente encontrada. Se desarrolla cuando descienden los linfocitos CD4 +. El diagnóstico se realiza encontrando filamentos del hongo en material de la lesión.
• Hystoplasma spp: Es una micosis profunda granulomatosa endémica. la histoplasmosis oral en pacientes HIV+ puede ser diagnóstico primario de SIDA

2-Virales:

• Epstein Barr. Se presenta como una lesión blanca de la lengua en formas de “parche”. En pacientes HIV+ su presencia indica progresión rápida a SIDA. El diagnóstico se realiza por hibridación, PCR o microscopía electrónica.
• Herpes simple. La lesión típica es la vesícula la cual se presenta en racimos o conglomerados. El diagnóstico se realiza por citología exfoliativa.
• Herpes humano-8:Esta relacionado con el Sarcoma de Kaposi. La lesión se instala preferentemente en los bordes del paladar y en la zona gingival. El diagnóstico debe confirmarse por biopsia.
• Papiloma humano (HPV): El condiloma acuminado es la lesión característica en la mucosa oral, siendo esta mas frecuente en pacientes con HIV. El diagnóstico se puede hacer4 por inmunohistoquímica, hibridación o PCR. (20)

INFECCIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

1-Meningitis Bacterianas:
El agente etiológico más frecuente es el Streptococcus pneumoniae, cuya resistencia a penicilina es un problema cada vez más frecuente. Otro germen menos frecuente e la Listeria monocytogenes. Mycobacterium tuberculosis agente etiológico de meningitis crónica en pacientes con SIDA. (22) (24)
Treponema pallidum ocasiona infecciones agudas o crónicas en el paciente con SIDA. La respuesta serológica no siempre es confiable por eso debe complementarse con :biopsias de lesiones cutáneas , examen de campo oscuro o con IFD del material de lesión. Treponema pallidum.
La coinfección de HIV con sífilis puede alterar la historia natural de la sífilis tanto en su diagnóstico como en la duración del tratamiento requerido para su curación. Además la sífilis puede tener una evolución más rápida por lo cual la punción de líquido cefalorraquídeo asumiría gran importancia en estos pacientes.
Diagnóstico: La observación en campo oscuro o la coloración de inmunofluorescencia directa de todo exudado de lesiones sospechosas se debe realizar y posee valor diagnóstico aún en pacientes con serología negativa. La detección del DNA treponémico usando PCR está cobrando amplia difusión para le diagnóstico de neurosífilis con resultados inciertos.

2- meningitis fúngicas:
Cryptococcus neoformans es el agente causal más frecuente en meningitis en los pacientes con SIDA. Su aislamiento siempre indica infección clínica o subclínica porque no forma parte de la flora normal. También puede aislarse de otros sitios como: sangre, medula ósea, pulmones, próstata suprarrenales y otros. El LCR es claro, con poca cantidad de células, leve aumento de proteínas y moderada a nula hipoglucorraquia. El diagnóstico se basa en la observación del agente en fresco, o con tinta china. También puede detectarse el antígeno al igual que cultivarse.

3-Encefalitis parasitarias:
Toxoplasma gondii: En los pacientes con SIDA la toxoplasmosis se manifiesta frecuentemente como una encefalitis necrotizante. Debido a un defecto en la inmunidad mediada por células se produce reactivación de la infección latente que el riesgo es mayor cuando el recuento de CD4 disminuye. Para el diagnostico la técnica de elección es la PCR, dado que las técnicas inmunológicas no son de utilidad en este caso.

En el laboratorio la demostración de inmunoglobulina G anti T Gondii en el paciente con SIDA esta relacionado con el potencial desarrollo de toxoplasmosis. Es necesario para distinguir entre infección latente y reactivación la titulación de los anticuerpos en dos muestras pareadas. En caso de detectar anticuerpos IgM se podría asegurar una infección reciente. La IgA anti T Gondii se encuentran raramente elevados en los pacientes con SIDA. La medición de IgE anti T Gondii es de cierta utilidad en el paciente con SIDA ya que se encuentra elevada en algunos pacientes con encefalitis toxoplásmica.
La detección del DNA por PCR es de relativa utilidad ya que su presencia en el tejido cerebral persiste, aún en ausencia de enfermedad actual.
Trypanosoma cruzzi: El chagoma cerebral es la manifestación mas frecuente de la enfermedad de Chagas en el paciente con SIDA. El diagnóstico:

• 1)En la búsqueda del parásito por métodos: a)directos en sangre y en LCR. b) Indirectos: xenodiagnóstico y hemocultivos. c) Biopsia importante para determinar el diagnóstico de Chagomas cerebrales. E)detección de antígenos del protozoo en orina. f)PCR.
• 2) Estudios serológicos: utilizados en la etapa crónica Estos son: Hemaglutinación indirecta, Aglutinación directa, fijación de complemento IFI y ELISA.
• 3 Meningitis virales: Causadas por. Epstein barr, Poliomavirus JC, Enterovirus, Herpes y Arbovirus.

INFECCIONES DE LA SANGRE:

Bacteriemias:
El agente etiológico más frecuente en pacientes con SIDA es el Rhodococcus equi Otros microorganismos son Enterococcus spp , Streptococcus grupo viridans, Stomatococcus mucilaginossus.

Fungemias:
La investigación de hongos en hemocultivos ha tomado importancia en los pacientes con HIV. Los más frecuentes aislados en SIDA son: C. neoformans y H. capsulatum. La metodología usada ha avanzado en las ultimas décadas. Los cuales comprenden:: Métodos bifásicos, lisis-centrifugación con saponina y métodos automatizados(BACTEC)

Micobacteriemias:
El cultivo de sangre para micobacteria comenzó a realizarse en forma más frecuente a partir del advenimiento del SIDA. El hallazgo de MAC se asocia con enfermedad avanzada de SIDA. También puede hallarse M. tuberculosis.(23)

INFECCIONES RESPIRATORIAS BAJAS

Las infecciones por agentes oportunistas son causa importante de enfermedad aguda y muerte en pacientes con enfermedad avanzada por HIV
Un de los microorganismos mas frecuentemente aislados es Pneumocystis carinii cuya presencia indica un estadio avanzado de la enfermedad (25)
En el siguiente cuadro ( 1) se enumeran las múltiples etiologías de la enfermedad pulmonar en los pacientes con HIV.
Las muestras pueden ser: Esputo, aspirado endotraqueal, lavado broncoalveolar, biopsia transbronquial, cepillado con cepillo envainado, lavado bronquial, biopsia de pulmón.
Pneumocystis carinii ha sido reconocido como causa de enfermedad en la población inmunocomprometida. Desde 1981 el número de neumonías por Pneumocystis carinii (PCP) fue incrementando paralelamente al aumento de casos sintomáticos de infección por HIV; tal es así que en los inicios de la epidemia en 1981, fue la enfermedad marcadora en grupos de homosexuales y drogadependientes endovenosos.
A pesar de la imposibilidad de cultivar a este agente fuera de los modelos animales, gracias a la aplicación de la biología molecular, hoy se sabe que es un hongo.
Se conoce como fuente de infección la inhalación de la bacteria a partir de un contacto cercano con portadores, los pacientes con conteos inferiores de células CD4 tienen mayor riesgo para desarrollar PCP.
El esputo inducido es efectivo para diagnosticar esta patología. La muestra de elección, sin embargo es el lavado bronqueoalveolar (BAL).
Su búsqueda se realiza por diferentes coloraciones. La sensibilidad se incrementa mediante el empleo de técnicas de anticuerpo fluorescente. Un resultado negativo en el BAL puede ser suficiente para excluir el diagnóstico de PCP. (26)
Mycobacterium-avium Complex diseminado (MAC) es una infección emergente muy común en el paciente con SIDA. La vía de invasión puede ser gastrointestinal o respiratoria. El aislamiento de MAC en un especimen respiratorio, precede frecuentemente la infección diseminada, y por otro lado la presencia de micobacterias dentro de los macrófagos en la pared intestinal sugeriría que el intestino sería la puerta de entrada. En el SIDA, MAC causa una infección diseminada con hemocultivos positivos.
Permanece aun desconocido si la diseminación de MAC resulta de una nueva adquisición ambiental o si es una reactivación de una infección latente. En el SIDA, la disfunción de los macrófagos permite la supervivencia del MAC dentro de los mismos, sumado a los bajos niveles de factor de necrosis tumoral, interferón gama e interleuquina 2.
Diagnóstico: Técnicas de hemocultivo especiales para el aislamiento de micobacterias, serían los métodos más sensibles para el diagnóstico de la infección (casi del 100% de sensibilidad). El empleo de sondas de DNA específicas para MAC, hace posible diferenciar en el término de horas la diferenciación de MAC de otras micobacterias.
El diagnóstico histológico a partir de biopsias de nódulos linfáticos, hígado o médula ósea presenta la ventaja de arrojar resultados mucho antes que el cultivo de la sangre (de 5 a 51 días). (21) (24)
La tuberculosis puede desarrollarse ya sea por una progresión directa a partir de una infección recientemente adquirida o por la reactivación de una infección latente. El riesgo de una progresión rápida es mucho mayor en personas con HIV.
La inmunidad mediada por células, es el mecanismo predominante mediante el cual la infección por tuberculosis se mantiene latente. La coinfección con HIV induciría fracasos en el tratamiento y aparición de cepas multiresistentes.
La tuberculosis tiende a ocurrir relativamente temprano en el curso de la infección por HIV, aún con recuentos relativamente altos de linfocitos CD4.
Diagnostico: Se realiza mediante la coloración de Ziehl Nielsen y el cultivo de las muestras respiratorias. En algunos casos, sin embargo es necesario realizar cultivos y coloraciones de materiales diferentes tales como nódulos linfáticos, médula ósea, orina o sangre. Con los métodos tradicionales se necesitan de seis a diez semanas para la detección del desarrollo. Las técnicas de cultivo radiométrico, o el empleo de sondas de DNA pueden acortar este proceso a aproximadamente diez días. El empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con su rapidez y alta especificidad resultan de creciente aplicación, en la medida en que se emplean regiones genómicas mas conservadas, que aumentan la sensibilidad de la técnica. Las pruebas cutáneas de tuberculina pueden dar reacciones bajas o ausentes en estos pacientes. Lo cual sería un indicador del estado de la inmunidad mediada por células. (23) (24)
La infección por Citomegalovirus (CMV) es extremadamente común en los pacientes con SIDA, en quienes causa enfermedades severas tales como corioretinitis, esofagitis, colitis, neumonía, y severos desórdenes neurológicos.
Virtualmente todos los pacientes con retinitis por CMV tienen recuentos de células CD4 menores de cincuenta.
Diagnóstico: La serología puede ser de alguna utilidad, obteniendo el titulo de IgG en dos muestras pareadas. También se puede investigar IgM anti CMV para determinar infección reciente. Las técnicas de biología molecular y de detección de antígeno temprano (pp 65) en los monocitos constituyen el recurso diagnóstico más rápido y efectivo para lograr un diagnóstico certero y poder realizar un tratamiento oportuno. (20)

Cuadro 1

BIBLIOGRAFIA:

1-Mandell,Douglas y Bennett. Enfermedades infecciosas. Principios y practica,1997; Cuarta edición parte I.PAG
2-Gaines H, Von Sydow MA, Von Stedingk LV (1990).Inmunological changes in primary HIV-1 infection.aids.4:995-999.
3-Gomez Carrillo, M, Mora , J, Russi, JC. Garantía de calidad en el diagnostico serologíco de la infección de la inmunodeficiencia humana, Organización Panamericana de la Salud.1995.
4-Coffin, John M, HIV viral dynamics; AIDS 1996,VOL(10) Suplemento 3 .575-583.
5-Mc Cutchan, Francine E, Salminen Mika O, Carr Jean K and Burke Donalds.HIV-1 genetyic diversity.AIDS.4.107-112.
6-Smith,MW.Constrasting genetic influence of CCR2 y CCR5 variants on HIV-1 infection and disease progression.Science.1997,277:959-965.
7-The Medical Management of AIDS.Sande-Volberding.Saunders 5ta edición.
8-Graziosi,C;Pantaleo G: Immunopathogenesis of HIV infection. AIDS res and Human Retrovirus.1998,vol.14,supl 2.135-142.
9-Saag,Ms,Holodniy M, Kuritzkes DR, O´Brien,WA, Coombs R, Poscher,ME, Jacobsen DM, Shaw GM, Richman DD, Volberding. HIV viral load markers in clinical practice, Nature Medicine, June 1996Vol 2, numero 6,.
10-Muchinik,G,Bouzas,M,Zala C, .Carga viral. Su significado e implicancias en el tratamiento y seguimiento del paciente con HIV. 1998,revista CA.DI.ME. pag 20-40.
11- LotharT. Clinical Laboratory Diagnostics: Use and assessment of clinical laboratory results, English edition, 1998.
12-Deluchi G, Ganizal A, Mangano, Bologna, Benettucci, Sen, .Aplicaciones de la PCR anidada para el diagnostico de infección por el HIV-1 en pediatría, noviembre 1997,Vol 5 (18).282-287.
13-Rizzardi,GP,Pantaleo,G:CCR2 polimorphism and HIV disease. Nature Med.1998,4:252-253.
14-Henrard DR, Phillips JF, MuenzL R, et al .Natural history of HIV-1 cell-free viremia .JAMA,1995;274:554-558.
15-Saag Michael S. Use of virologic markers in clinical practice .Journal of Acquired Immune Deficiency Síndromes and Human Retrovirology.1997 vol. 16 suple 1 S3-S13
16-Obrien WA, Hartigan PM, Martin D, et al .Changes in plasma HIV-1 RNA and cd4+ limfphocyte counts and the risk of progression to AIDS-N Eng J Med.1996;334:426-431.
17-Oficina de HIV/SIDA y enfermedades de transmisión sexual. Organización Mundial de la Salud. GINEBRA. en colaboración con UNAAIDS, las implicancias de los tratamientos antirretrovirales, Actualizaciones en SIDA,1997.VOL 5 (18) 236-261.
18-Clotet,B,rUIZ l, Paredes, R. Resistencia primaria al HIV-1 .Actualizaciones en el SIDA .vol. 7 (24) junio 1999.65-71.
19-Salomon H, Gómez Carrillo M, Pampuro S, Aunla M, Waimberg M. Técnicas para evaluar la resistencia a drogas del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV).Actualizaciones en SIDA junio 1999,vol 7 (24) 72-77.
20-Infecciones en el paciente inmunocomprometido incluido SIDA. Asociación Argentina de Microbiología. Modulo 19.enero 2000.
21-Chin DP Yajko DM, Hopenell PC, et al Mycobacterium avium complex in the respiratory o gastrointestinal tract and the risk of Mycobacterium avium complex bacteriemia in patients with HIV, 1994 J Infect Disease,169:289-295.
22-CDC:Cases of specified notificsable diseases. United States, 1992 MMWR 39: 944
23-Chin DP, Yajko DM, Hadleywk et al Clinical utility of a commercial test based on PCR, for detection Mycobacterium Tuberculosis in respiratory Specimen, Am 1995 J Respir Crit Care MED 151:1872-1877.
24-Bishburg E, Sunderamg. Central nervous system tuberculosis with AIDS and its related complex .An Intern Med.1996 105-201.
25-Edman JC, Sogin ML:Molecular phylogenetics of P carinii.In Walger PD eds PCP New York Marcel Dekker,Inc,1994.VOL 69 91-105.
26-Eisen D, Ross BC, Fairbairn J et al: Comparison P, Carinii detection by toluidine blue o staining, DFA and DNA amplification in sputum specimen form HIV positive patiens. 1996 AIDS 125-127.
27-Bosio J C, Troncoso R .Revista Argentina de Infectologia Diagnostico molecular en enfermedades infecciosas.1996 VOL IX N 7