Adem\u00e1s, sirve para\u00a0comprender con m\u00e1s detalle el rol que juega cada uno de los genes conocidos en las distintas funciones descritas. Sin embargo, las t\u00e9cnicas de Segunda Generaci\u00f3n (NGS), todav\u00eda, son plataformas relativamente caras y que precisan de unas necesidades espec\u00edficas. Los protocolos propios de dichos m\u00e9todos, incorporan una etapa de amplificaci\u00f3n del ADN a secuenciar, que puede llevar a la introducci\u00f3n de errores con facilidad. Adem\u00e1s, las secuencias ricas en AT o AG dan lugar a sesgos que complican el posterior an\u00e1lisis bioinform\u00e1tico de ensamblaje, debido a una representaci\u00f3n insuficiente en lecturas de estas regiones.<\/p>\n
Por ello, la idea de buscar un alternativa m\u00e1s sencilla, r\u00e1pida y eficaz, y al menor coste posible, es una cuesti\u00f3n que siempre ha estado y est\u00e1 en la mente de los cient\u00edficos. Con este fin, nace lo que se conoce como Secuenciaci\u00f3n de Tercera Generaci\u00f3n. Aunque algunas de estas plataformas, o bien se encuentran todav\u00eda en fase de experimentaci\u00f3n o requieren de la mejora en muchos de sus aspectos, se consideran como uno de los avances m\u00e1s esperados para esta segunda d\u00e9cada del siglo XXI. Todas las estrategias se fundamentan en la idea de eliminar la etapa de PCR, y tratar de realizar la propia secuenciaci\u00f3n a partir de una \u00fanica mol\u00e9cula de ADN. Al mismo tiempo que se trata abaratar los costes, conseguir ofrecer lecturas m\u00e1s largas que faciliten el posterior ensamblado y ampliar el abanico de aplicaciones, como la detecci\u00f3n de grandes variaciones en la estructura de los cromosomas o caracterizaci\u00f3n de haplotipos, entre otras.<\/p>\n
Aunque a priori, parece algo pr\u00e1cticamente imposible, ya existe en el mercado la tecnolog\u00eda Single Molecule, Real-time (SMRT), desarrollada por la casa Pacific Biosciencies, que trata de ofrecer una secuenciaci\u00f3n de estas caracter\u00edsticas. Como su propio nombre nos lleva a intuir, es una plataforma que utiliza la fluorescencia para secuenciar una \u00fanica mol\u00e9cula de ADN en tiempo real. El dise\u00f1o se basa en nanopocillos, en cuya base existe un orificio, denominado zero-mode waveguide (ZMW), por donde es posible el paso de la luz. En cada ZMV, queda inmovilizada una \u00fanica mol\u00e9cula junto con una sola enzima de ADN polimerasa. Tras la incorporaci\u00f3n de los nucle\u00f3tidos, cada uno marcado con un fluor\u00f3foro de un color distinto, por parte de la ADN polimerasa a la hebra en s\u00edntesis, se libera el fluor\u00f3foro que es excitado por el haz de luz, siendo detectable por el detector. De esta forma, es posible saber que nucle\u00f3tido se ha incorporado, y as\u00ed, elucidar la secuencia desconocida.<\/p>\n
SMRT permite incorporar lecturas de unas 60.000 pares de bases (bp), por lo que supone un atractivo para aquellos estudios en los que se tratan de averiguar variaciones estructurales o que presentan dificultades en la amplificaci\u00f3n de ciertas \u00e1reas del genoma. Tambi\u00e9n tiene la ventaja de que es capaz de secuenciar bases modificadas, como la 5\u2019-metil-citosina, gracias a que es posible la incorporaci\u00f3n de este tipo de nucle\u00f3tidos. Sin embargo, a d\u00eda de hoy, se trata de una metodolog\u00eda que requiere de grandes cantidades de ADN para poder ofrecer un resultado s\u00f3lido, ya que no amplifica, por lo que no es apto para un proyecto de secuenciaci\u00f3n del genoma completo. Adem\u00e1s, adquirir el equipamiento necesario supone una gran inversi\u00f3n inicial, y el posterior mantenimiento resulta muy caro. Todo limitaciones que est\u00e1n tratando de resolverse de cara a los pr\u00f3ximos a\u00f1os.<\/p>\n
Recientemente, en apenas dos a\u00f1os, ha surgido otra estrategia que ha entrado en el mercado como una aut\u00e9ntica revoluci\u00f3n por su amplia versatilidad. Es el caso de la t\u00e9cnica de secuenciaci\u00f3n mediante Nanoporos, un m\u00e9todo de secuenciaci\u00f3n que permite secuenciar secuencias de ADN individualizadas, de forma directa, barata y en el mismo momento. Aunque todav\u00eda se encuentra en v\u00edas de optimizaci\u00f3n, otra ventaja que supone frente al resto de tecnolog\u00edas, es que ser\u00e1 capaz de secuenciar toda la longitud de la secuencia a analizar, en lugar de generar lecturas de un tama\u00f1o espec\u00edfico. A esto es lo que se comienza a llamar como capacidad de ofrecer lecturas \u201cultra largas\u201d<\/p>\n
Todo esto se consigue, gracias a que esta tecnolog\u00eda est\u00e1 basada en el principio de leer directamente el fragmento de ADN a secuenciar mediante el paso de dicha mol\u00e9cula \u00fanica por un nanoporo, a la vez que se va midiendo los efectos, a nivel i\u00f3nico y el\u00e9ctrico, que supone el avance del ADN.<\/p>\n
Al igual que en SMRT, la secuenciaci\u00f3n mediante nanoporos tambi\u00e9n presenta la limitaci\u00f3n de que se requiere de una gran cantidad de ADN, para poder secuenciar y obtener un resultado fiable. Secuenciar una \u00fanica mol\u00e9cula, tiene el inconveniente, es que se necesita de la secuenciaci\u00f3n de muchas mol\u00e9culas \u00fanicas para poder obtener una secuencia consenso aceptable entre todas las id\u00e9nticas y se eliminen los posibles errores introducidos.<\/p>\n
Si se consiguiera superar esta barrera, y ofrecer una precisi\u00f3n de secuenciaci\u00f3n lo suficientemente alta incrementando el rendimiento a unos niveles superiores a los ya existentes, este tipo de tecnolog\u00edas podr\u00edan comenzar a implantarse en las disciplinas emergentes como la medicina personalizada o la farmacogen\u00e9tica, por citar solo un par de ejemplos.<\/p>\n