En el marco de la Unidad Coronavirus COVID-19 impulsada por el MINCyT, el CONICET y la Agencia I+D+i, esta semana se lograron avances en la validaci\u00f3n de un m\u00e9todo r\u00e1pido y port\u00e1til de diagn\u00f3stico molecular del Sars-CoV-2 que usa tecnolog\u00eda CRISPR, al ser probado con \u00e9xito en extra\u00eddos de muestras de pacientes que fueron aportadas por la Administraci\u00f3n Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud ANLIS \u201cDr. Carlos G. Malbr\u00e1n\u201d, dependiente del Ministerio de Salud de la Naci\u00f3n.<\/p>
Estos avances parten desde el kit diagn\u00f3stico port\u00e1til desarrollado por la startup CASPR Biotech (empresa de base biotecnol\u00f3gica bajo normativa CONICET impulsada por GridX, una incubadora nacional de empresas de Biotecnolog\u00eda) que permite detectar el material gen\u00e9tico del virus a trav\u00e9s de una tira reactiva (similar a las que se usan en los test de embarazo) y que fue dado a conocer p\u00fablicamente en febrero de este a\u00f1o.<\/p>
\u201cEn aquel momento, nosotros hab\u00edamos puesto a punto la utilidad de la tecnolog\u00eda CRISPR para detectar el COVID-19 en muestras de saliva inoculadas con fragmentos cortos sint\u00e9ticos del virus (SARS-CoV-2) que sintetizamos en el laboratorio una vez que fue dado a conocer su c\u00f3digo gen\u00e9tico. Hoy pudimos probar que el test de detecci\u00f3n tambi\u00e9n funciona en muestras de pacientes infectados y estos resultados pueden detectarse con claridad en tiras reactivas de papel. Estos nuevos resultados representan un paso contundente en el camino de validar la tecnolog\u00eda CRISPR como m\u00e9todo de diagn\u00f3stico\u201d, indica Federico Pereyra-Bonnet, investigador del CONICET en la Unidad Ejecutora de Investigaciones en Producci\u00f3n Animal (INPA, CONICET-UBA) e integrante de CASPR Biotech.<\/p>
Las veinte muestras de material gen\u00e9tico \u2013diez correspondientes a pacientes infectados con coronavirus y diez de pacientes que no ten\u00edan el COVID-19- analizadas para poner a prueba el m\u00e9todo de testeo por CRISPR, ya hab\u00edan sido previamente procesadas mediante RT-PCR, la metodolog\u00eda de retrotranscripci\u00f3n seguida por reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa<\/strong> (PCR, por sus siglas en ingl\u00e9s), que es la t\u00e9cnica de diagn\u00f3stico molecular validada que usan el Instituto ANLIS\/ Malbran y los centros descentralizados.<\/p> La metodol\u00f3gica RT-PCR, al igual que la tecnolog\u00eda CRISPR, apunta a reconocer en las muestras la huella digital del virus (su c\u00f3digo gen\u00e9tico expresado en una secuencia de ARN), pero implica procesos m\u00e1s largos que requieren a su vez de una infraestructura de mayor complejidad as\u00ed como del uso de reactivos importados y m\u00e1s costosos.<\/p> Diferentes m\u00e9todos de testeo: directos e indirectos<\/strong><\/p> \u201cEs importante poder distinguir entre los diferentes m\u00e9todos de testeo que existen para la detecci\u00f3n del Covid-19 o de cualquier otro virus respiratorio, y tener en cuenta, al margen de la velocidad con la que puedan ofrecer resultados confiables, las distintas tecnolog\u00edas en las que se basan y a lo que apunta cada una de ellas. Por un lado, est\u00e1n los m\u00e9todos directos de detecci\u00f3n viral<\/strong> que pueden buscar reconocer un ant\u00edgeno viral o -en el caso de las t\u00e9cnicas moleculares como PCR o CRISPR- una determinada secuencia gen\u00e9tica indicativa de la presencia del virus. Por otro lado, est\u00e1n los m\u00e9todos indirectos, como los basados en an\u00e1lisis serol\u00f3gicos, que permiten identificar la presencia de los anticuerpos que forman parte de la respuesta inmune a un determinado virus. Todos las metodolog\u00edas sirven y pueden ser las m\u00e1s adecuadas para diferentes fines o situaciones\u201d, indica la especialista en virus respiratorios D\u00e9bora Marcone, investigadora del CONICET en el Departamento de Microbiolog\u00eda, Inmunolog\u00eda, Biotecnolog\u00eda y Gen\u00e9tica de la Facultad de Farmacia y Bioqu\u00edmica de la Universidad de Buenos Aires (FFyB, UBA), quien se uni\u00f3 al proyecto a partir de la conformaci\u00f3n de la Unidad Coronavirus Covid-19.<\/p> \u201cEn este sentido, la tecnolog\u00eda CRISPR (al igual que lo que ocurre con PCR) podr\u00eda servir para diagnosticar la infecci\u00f3n desde que el paciente comienza con las manifestaciones cl\u00ednicas o incluso antes, porque lo que permite es detectar el genoma del virus -o sea la presencia del pat\u00f3geno en el organismo- y no la reacci\u00f3n inmunol\u00f3gica que desencadena\u201d, se\u00f1ala la investigadora.<\/p> CRISPR como m\u00e9todo de diagn\u00f3stico<\/strong><\/p> La tecnolog\u00eda CRISPR es un desarrollo relativamente reciente que en los \u00faltimos a\u00f1os revolucion\u00f3 el campo la biotecnolog\u00eda, conocida por la precisi\u00f3n con la que permite introducir modificaciones gen\u00e9ticas, lo que se conoce como edici\u00f3n g\u00e9nica, a trav\u00e9s de cortes espec\u00edficos en las secuencias de ADN. Por este motivo se habla metaf\u00f3ricamente de CRISPR como una \u2018tijera molecular\u2019. Menos conocida es hasta ahora la posibilidad que ofrece esta t\u00e9cnica para diagnosticar infecciones virales a trav\u00e9s de la identificaci\u00f3n de secuencias gen\u00e9ticas.<\/p> \u201cNosotros llamamos a CRISPR el Google de la naturaleza. A modo de ejemplo, se dice que CRISPR puede encontrar una palabra de veinte letras en una biblioteca con un mill\u00f3n de libros que tengan un mill\u00f3n de palabras cada uno adentro. Digamos que es extremadamente eficiente buscando y encontrando secuencias. CRISPR es en la naturaleza un sistema de defensa que tienen las bacterias y arqueobacterias para detectar virus y destruirlos. Por eso esperamos que el d\u00eda de ma\u00f1ana CRISPR sirva tambi\u00e9n directamente para el tratamiento de infecciones. Pero por ahora queremos que nos ayude con su detecci\u00f3n\u201d, indica Pereyra-Bonnet.<\/p> El sistema CRIPSR cuenta con una prote\u00edna principal llamada Cas, de la que hay diferentes clases. Aunque para la edici\u00f3n g\u00e9nica se usa la Cas9, para la identificaci\u00f3n del material gen\u00e9tico de los virus, los investigadores se valen de la Cas12. Al igual que Cas9, Cas12 encuentra una secuencia espec\u00edfica de ADN para la que fue programada y produce un corte puntual, pero tras hacerlo realiza tambi\u00e9n una serie de cortes indiscriminados. Es esta \u00faltima reacci\u00f3n la que se puede detectar mediante un lector de placas en un laboratorio o a trav\u00e9s de la tira reactiva de papel de un kit portable.<\/p> La ventaja que ofrecen los test de diagn\u00f3stico en base a CRISPR es que se pueden adecuar sin grandes costos para detectar la presencia de cualquier virus, siempre y cuando se conozca su secuencia.<\/p> Desaf\u00edos por delante<\/strong><\/p> Las muestras aportadas por el Anlis\/Malbran que recientemente fueron procesadas con \u00e9xito llegaron en forma de lo que se conoce como ARN viral o material gen\u00e9tico del virus. El aislamiento del ARN viral una vez que se realiza el hisopado nasofar\u00edngeo (u otro tipo de extracci\u00f3n para una muestra respiratoria) es una tarea compleja y que requiere de importantes medidas de seguridad. Uno de los desaf\u00edos que se plantean los investigadores, complementarios con el perfeccionamiento del m\u00e9todo de detecci\u00f3n por CRISPR, es desarrollar un dispositivo port\u00e1til que permita tambi\u00e9n de forma r\u00e1pida y segura poder separar el material gen\u00e9tico a analizar.<\/p> \u201cLo \u00f3ptimo ser\u00eda poder desarrollar un dispositivo port\u00e1til completo de manera que la muestra pueda ser tomada y manipulada de forma segura por personal de salud. Para eso se tendr\u00eda que poder aislar material del virus \u2013en este caso del SARS-CoV-2, pero podr\u00eda ser cualquier otro- sin necesidad de una c\u00e1mara de bioseguridad o de un equipamiento muy sofisticado, para que se pueda hacer el diagn\u00f3stico por CRISPR\u201d, explica la genetista Ivana Primost, investigadora del laboratorio de Biolog\u00eda Molecular del Hospital Municipal de Trauma y Emergencias Dr. Federico Abete (ubicado en la localidad bonaerense de Malvinas Argentinas) y especialista en diagn\u00f3stico molecular de enfermedades infecciosas, quien tambi\u00e9n colabora con el proyecto CASPR y forma parte de la Unidad COVID19.<\/p> En este sentido uno de los pasos en los que est\u00e1n actualmente trabajando contra reloj es la b\u00fasqueda de un l\u00edquido (buffer) en el que se pueda depositar la muestra respiratoria cruda de forma tal que inactive el virus, pero al mismo tiempo no arruine la calidad del material extra\u00eddo para hacer el testeo.<\/p> \u201cPensar que uno puede tomar un hisopado a un paciente y a la hora tener un resultado con la misma confianza que hoy otorga un estudio hecho por PCR es un desaf\u00edo muy interesante y creo que lo vamos a lograr\u201d, concluye Primost.<\/p> Por Miguel Faig\u00f3n<\/strong><\/p> Sobre la investigaci\u00f3n:<\/strong><\/p>